Il museo nasce nel 1808 come quadreria dell’Accademia di Belle Arti, l’istituto d’istruzione sorto dalle ceneri della settecentesca Accademia Clementina. Il suo nucleo più antico proviene dall’Istituto delle Scienze, per dono di Francesco  Zambeccari nel 1762. Esso venne arricchito dalla straordinaria raccolta di quasi mille dipinti che, in età napoleonica, furono il frutto delle soppressioni di chiese e conventi compiute fra 1797 e 1810.

Negli spazi di quello che era stato il noviziato gesuitico di S. Ignazio riformulato fra 1726 e 1732 dall’architetto Alfonso Torreggiani - la Pinacoteca conobbe per tutto l’Ottocento incrementi di sale e di opere, sia per acquisti che per le nuove soppressioni attuate dal nuovo stato unitario nel 1866. Vi furono anche nuovi lasciti, come il secondo massiccio nucleo Zambeccari che giunse al museo nel 1883, un anno dopo la sua emancipazione dall’Accademia.

L’attuale percorso espositivo si deve all’architetto Leone Pancaldi, sotto la guida del soprintendente Cesare Gnudi. In questa occasione fu ricavato l’attuale scalone di accesso, nello spazio dell’antica cappella detta del Noviziato, affescata da Giuseppe Barbieri con la Gloria di sant’Ignazio, dove in passato i giovani venivano accolti nell’Ordine gesuitico. Al piano superiore il Gabinetto dei Disegni e delle Stampe, ricco di migliaia di pezzi, è celebre soprattutto per l’importante raccolta di stampe, formata principalmente sui doni del papa bolognese Benedetto XIV Lambertini (1751 e 1756).